Методика проведения иммуногистохимического исследования

Иммуногистохимические исследования – важный этап современной морфологической диагностики, основанный на проведении реакции между антигенами опухоли и вводимыми антителами, видимой при окрашивании хромогеном. Эти исследования требуют осуществления нескольких подготовительных этапов перед непосредственно аналитическим. Качество их проведения существенно влияет на результат анализа.

Биопсия

Морфологические исследования требуют для своего осуществления образцы опухоли. Поэтому исследование начинается с проведения биопсии – забора кусочков опухоли у пациента. Эта процедура может проводиться как амбулаторно, так и в виде операции (возможно с удалением опухоли целиком). Образцы ткани сразу помещают в раствор забуференного 10%-ного формалина, каждый кусочек в свой отдельный контейнер с маркировкой. Контейнеры с образцами доставляют в патоморфологическую лабораторию, где начинается этап подготовки к анализу – фиксация и проводка материала.

Фиксация

Фиксация проводится для изменения  структуры белков с целью предохранить их от вымывания, деградации или других изменений, которые могут происходить в нормальной нефиксированной ткани. Кроме предотвращения деградации или вымывания антигена, фиксация также должна сохранять распределение антигена (ядерное, цитоплазматическое или мембранное) и, насколько это возможно, его вторичную и третичную структуру, чтобы обеспечить сродство для антител, которые в дальнейшем будут использоваться для обнаружения антигена.  Ошибки на этом этапе приведут к неверной интерпретации результатов окрашивания. Для минимизации ошибок при фиксации применяются стандартные растворы и протоколы фиксации, валидизация реактивов.

Существует много различных типов фиксирующих растворов, однако наиболее часто используемый для фиксации реагент – 10% раствор нейтрального забуференного формалина. Он быстро проникает в ткань, а затем медленно ее фиксирует. Формалин особенно хорошо фиксирует маленькие молекулы, такие например как гормоны. Очень важно соблюдать оптимальное время фиксации, которое может варьировать от одной комбинации антиген-антитело к другой. В среднем, она занимает около 6-12 часов.

Проводка

На этапе проводки фиксированные образцы обрабатывают последовательно серией растворов спирта, ксилола, а затем горячего парафина, чтобы придать стабильность и эластичность ткани. Так получаются парафиновые гистологические блоки. Затем на микротоме нарезаются тонкие пленки для изготовления гистологических стекол – толщина их не может составлять более 5 мкм, так как это будет мешать интерпретации результата окрашивания. Эти тонкие пленки ткани помещаются в емкость с водой и там переносятся на стекла с адгезивным составом. Затем проводится процедура очистки от остатков парафина, обратная процессу изготовления парафиновых блоков.

Окрашивание и исследование

Полученные стекла окрашиваются сначала гематоксилином-эозином, а затем проводится окрашивание антителами выбранной врачом панели и проявление реакции хромогеном. Эти этапы могут проводиться вручную, либо быть автоматизированными, что повышает качество окрашивания.

Затем готовые стекла попадают к врачу-патоморфологу, который изучает их под микроскопом и ставит диагноз. При наличии сомнений в постановке диагноза могут проводиться дополнительные консультации готовых стекол с другим специалистом, называемые пересмотром гистологических стекол.